Central laboratory, MEBO Global Group 100053

[Abstract]： Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on the lesion of gastrointestinal tract through testing the effect of GIC on survival and growth of organ-type explants of gastric tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of gastric tissue of mouse embryo in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants in test group could survive，single cells and cell clones from explants grew well and long. However, explants, cells and cell clones in control group died off after a short period of time. There was significant difference between two groups. Conclusion: MEBO could promote survival and growth of cells of gastric explants of mouse embryo and this process may be related to activation of epithelial stem cells.

[Key words]： GIC; gastric explant; growth　　

　　本實(shí)驗(yàn)的目的在于通過體外檢測GIC對胚胎小白鼠胃組織器官型植塊生長的影響以初步探討GIC治療粘膜損傷性疾病的機(jī)理。

　　一. 儀器、設(shè)備、材料、試劑及實(shí)驗(yàn)動物

　　超凈工作臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備二廠）、培養(yǎng)箱（美國Forma）、超級恒溫水浴及恒溫電烤箱（重慶四達(dá)）、冰箱（江蘇長嶺）、倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）、顯微成像分析系統(tǒng)（上�？迫穑⑽⒉t（廣東Galanz）、微型計(jì)算機(jī)（北京沐澤）、光學(xué)顯微鏡（江蘇光學(xué)儀器廠）、各種型號注射器、12孔培養(yǎng)板（丹麥NUNC）、50ml離心管、Eppendorf離心管、微量加樣器（1000μl、200μl、20μl、10μl, 均為法國Gilson）、大小滴頭、培養(yǎng)皿（φ5cm、φ6cm）、0.22μm微孔濾膜、針頭濾器、各種眼科手術(shù)器械、顯微外科器械、有蓋三角燒瓶、有蓋小試管、針頭、GIC（本公司生產(chǎn)）、MEM培養(yǎng)基（美國Hyclone）、胎牛血清（杭州三利）、青霉素和鏈霉素（華北制藥）等。

　　實(shí)驗(yàn)動物：昆明種胚胎鼠。

　　二. 實(shí)驗(yàn)方法：

　　1．取一只孕16日齡的昆明種雌性小白鼠，頸椎脫臼法處死，先置于75%乙醇中浸洗一遍（2分鐘），再置于75%乙醇中消毒5分鐘；

　　2．用眼科剪以及止血鉗先剪開雌鼠的腹部皮膚，鈍性分離至兩側(cè)，充分暴露腹壁肌肉，然后小心剪開腹壁全層，切勿傷及內(nèi)臟及小鼠胚胎；

　　3．剪開子宮，從宮腔中取出胚胎鼠，置入無菌平皿中；

　　4．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠體表洗滌兩次，每次1分鐘；

　　5．用顯微外科剪刀將胚胎鼠的腹壁剪開，再用顯微外科鑷子夾起鼠胃，自賁門及幽門部切斷，得到全胃，切掉并棄去近賁門的1/3，然后沿胃大彎處縱行切開鼠胃，充分暴露胃粘膜；

　　6．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠胃連續(xù)洗滌兩次，每次1分鐘；

　　7．將鼠胃置于含雙抗的MEM培養(yǎng)液中浸洗2次，每次１分鐘；

　　8．將鼠胃剪成極小的器官型植塊，面積約1mm×1mm；

　　9．將植塊置于12孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中央，每孔5塊，間隔約2mm，布局合理，粘膜面向上，輕輕按壓每塊植塊，使其緊貼培養(yǎng)板的表面；

　　10．沿培養(yǎng)孔的邊緣，緩慢加入約0.5ml的完全MEM培養(yǎng)液，勿使培養(yǎng)液與植塊接觸；

　　11．將培養(yǎng)板置于37、５％培養(yǎng)箱中預(yù)孵育1小時(shí)；

　　12．每孔加完全MEM培養(yǎng)液2ml，輕拿輕放，切勿使植塊飄起，實(shí)驗(yàn)組加GIC；

　　13． 實(shí)驗(yàn)組和對照組同步等量換液，每次去掉原液的1/2左右, 再加入相同量的新鮮MEM培養(yǎng)液；

　　14．用倒置顯微鏡觀察植塊生長情況，用顯微成像記錄分析系統(tǒng)記錄所觀察的結(jié)果，并用計(jì)算機(jī)保存圖像。

　　三．實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　細(xì)胞全程培養(yǎng)111天以內(nèi)的報(bào)告：培養(yǎng)過程中未出現(xiàn)污染，實(shí)驗(yàn)組和對照組的胃組織植塊剛開始培養(yǎng)時(shí)，能固定在培養(yǎng)孔中央，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，植塊先后慢慢脫離培養(yǎng)孔底部，游離飄浮于培養(yǎng)液中，但仍然貼近培養(yǎng)孔底部，并且大多集中于培養(yǎng)孔中央，植塊的大小和形狀幾乎沒有變化。這是培養(yǎng)前7天的情況。

　　實(shí)驗(yàn)組植塊和對照組植塊在培養(yǎng)的前７天，組織塊是完整的，但從培養(yǎng)的第8天開始，組織塊就開始逐漸松解，并最終成為肉眼不易察覺的組織塊，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組和對照組的視野中出現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞以及細(xì)胞克隆，在體外培養(yǎng)的第１８天，對照組中的單個(gè)細(xì)胞以及細(xì)胞克隆逐漸變黑、皺縮、死亡、硬結(jié)，而此時(shí)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長繼續(xù)呈現(xiàn)良好的生長態(tài)勢，單個(gè)細(xì)胞很多，在視野中到處可見，細(xì)胞類型大多為圓形或橢圓形，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞是典型的活細(xì)胞，以培養(yǎng)孔中央數(shù)量最多，越靠近培養(yǎng)孔邊緣細(xì)胞越少，邊緣幾乎沒有，同時(shí)細(xì)胞克隆數(shù)也逐漸增多，每個(gè)克隆所含有的細(xì)胞個(gè)數(shù)也越來越多。這種明顯的差別在其它器官型植塊的培養(yǎng)中也曾經(jīng)反復(fù)出現(xiàn)過，主要與營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)有關(guān)。顏色變深往往是組織細(xì)胞變性壞死的前兆，說明單純的MEM培養(yǎng)基無法提供給組織塊合適而充足的營養(yǎng)，恰恰相反，GIC以其豐富的營養(yǎng)從一開始便能使組織處于一個(gè)與體內(nèi)環(huán)境相差不大的生長環(huán)境中，充分保證了組織和細(xì)胞的活性。

　　下面為實(shí)驗(yàn)組和對照組的對比圖，從中可以看到差別是何等之明顯。

圖1　培養(yǎng)第24天。圖1A為對照組，圖1B為實(shí)驗(yàn)組。對照組中的胃組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實(shí)驗(yàn)組中顯示的是細(xì)胞克隆。
圖2　培養(yǎng)第30天。圖2A為對照組，圖2B為實(shí)驗(yàn)組。對照組中殘留的是胃組織細(xì)胞碎片，實(shí)驗(yàn)組中是一個(gè)細(xì)胞克隆。
圖3　培養(yǎng)第38天，圖3A為對照組，圖3B為實(shí)驗(yàn)組。對照組中殘留的是胃組織細(xì)胞碎片，實(shí)驗(yàn)組中是一個(gè)細(xì)胞克隆，克隆中的細(xì)胞生長良好。
圖4　培養(yǎng)第42天，圖4A為對照組，圖4B為實(shí)驗(yàn)組。對照組中殘留的是胃組織細(xì)胞碎片以及細(xì)胞克隆碎片，實(shí)驗(yàn)組中是細(xì)胞克隆。